Диагноз при синдроме Кляйнфельтера устанавливают на основании характерных жалоб и внешнего вида больных, изменения яичек при пальпации и ультразвуковом исследовании. В крови пациентов снижен уровень тестостерона, в моче регистрируется повышенный уровень характерного для женщин фолликулостимулирующего гормона. Подтверждает диагноз генетическое исследование - в клетках обычно четко выявляется характерное для женского пола тельце Барра.