Ферменты.

Ферментные метки обладают чрезвычайно мощьным каталитическим действием, одна молекула фермента может реагировать с большим количеством молекул субстрата. Таким образом, фермент, присутствующий в ничтожных количествах, можно выявить и количественно определить по образованию продуктов, катализируемой им реакции. Другое преимущество применения ферментов в качестве меток обусловлено наличием в молекуле многочисленных функциональных групп (сульфгидрильных, карбоксильных, остатков тиразина и др.), через которые можно ковалентно присоединить молекулы лиганда.

Ферментные маркеры, используемые в ИФА, должны обладать следующими свойствами:

– высокая активность и стабильность фермента в условиях анализа, при модификации и в конъюгате с антителами или другими белками;

– наличие чувствительных субстратов и простота метода определения продуктов или субстратов ферментативной реакции;

– возможность адаптации субстратных систем к дальнейшему усилению;

– отсутствие фермента и его ингибиторов в исследуемой биологической жидкости.

В ИФА может использоваться не менее 15 различных ферментов. Наибольшее применение, в соответствии с вышеназванными требованиями, нашли пероксидаза хрена (ПХ), щелочная фосфотаза (ЩФ) и β-D-галактозидаза (табл.1). Все три стабильны и катализируют высокочувствительные реакции. Кроме того, продукты, получаемые в результате реакций, катализируемых этими ферментами, в зависимости от используемого субстрата, могут выявляться не только колориметрическими методами, но также флуоресцентными методами. Другие ферменты используются значительно реже. Это объясняется их более низкой в сравнении с ПХ и ЩФ удельной активностью.

Субстраты.

Выбор субстрата в первую очередь определяется используемым в качестве метки ферментом, так как реакция фермент-субстрат высоко специфична.

Основные требования к субстрату:

– обеспечение высокой чувствительности метода при выявлении фермента в конъюгате;

– образование хорошо учитываемых (например, окрашенных) продуктов реакции фермент-субстрат;

– субстрат должен быть безопасным, дешевым, доступным и удобным для применения.

Таблица 1.

Ферменты и их субстраты наиболее широко используемые в ИФА.

Фрмент

Источник получения

М.М. (кДа)

Субстрат (рекомендуемая длина волны при фотометрии, нм)

Конъюгирующий реагент

Пероксидаза хрена

Хрен (Armoracia rusticana)

40

О-фенилендиаминдигидро-хлорид (ОФД, 492 нм)

5-аминосалициловая кислота (450 нм), диаминобензидин, о-дианизидин.

Глутаральдегид

Мета-периодат натрия

N-сукцинимидил-3 (2-пиридилдитио) пропионат

β-D-галак-тозидаза

E. Coli

540

О-нитрофенил-β-D-галактозид (420 нм)

Мета-малеимидобензол-N-гидроксисукцинимидный эфир

Щелочная фосфотаза

E. Coli, слизистая кишечника теленка

84-150

Р-нитрофенилфосфат (405 нм), 5-Бром-4-хлоро-3-индолил фосфат

Глутаральдегид

Чаще используют хромогенные субстраты, которые, разрушаясь, образу­ют окрашенное вещество. Перспективным является использование высокоэнергетических субстратов – флуоресцентных, хемипюминесцентных. Применение таких субстратов позволяет теоретически повысить чувствительность ИФА на два порядка.

Антигены и антитела.

АГ и AT, используемые в ИФА, должны быть высокоочишенными и высокоактивными. Кроме того, АГ должны обладать высокой антигенностью, оптимальной плотностью расположения и количеством антигенных детерминант, чужеродностью и гомогенностью. Многие синтетические и рекомбинантные АГ вирусов и бактерий хорошо себя зарекомендовали при использовании в ИФА. Это существенно повысило специфичность и воспроизводимость метода за счет сведения к минимуму перекрестных реакций.

Одним из наиболее важных реагентов в ИФА являются антитела. Чувст­вительность ИФА зависит от концентрации, активности и специфичности ис­пользуемых антител. Используемые антитела могут быть поли- или монокли­нальными, различного класса (IgG или IgM) и подкласса (IgGl, IgG2), антиаллотипическими или антиидиотипическими. При низкой аффинности AT распад комплекса АГ-АТ приводит к удалению связанного АГ из системы. Чув­ствительность и специфичность метода повышается при использовании моноклональных антител. В этом случае появляется возможность обнаруживать низкие концентрации АГ (AT) в испытуемых образцах.

Страницы: 1 2 3

Смотрите также

Заключение
О причинах возникновения маниакально-депрессивного психоза существуют различные концепции, но большинство авторов считает, что основной причиной является неполноценность  самого организма.&nbs ...

Методы оценки инсулинорезистентности и гиперинсулинемии, биохимические критерии метаболического синдрома Х
Как уже отмечалось, в основе развития метаболического синдрома Х лежит резистентность тканей к инсулину. “Золотым стандартом” измерения чувствительности тканей к инсулину является эугликемический г ...

Системная красная волчанка и уважение пациенткой наследия своего народа
  У другой пациентки Штефана Хаузнера, также уроженки Аргентины, в ходе проведенного интервью, была выявлена связь между отсутствием благословения на брак у бабушки пациентки и существующей ...







www.medicinformer.ru - Copyright © - 2019